Tinciones de Gram: principio, procedimiento y resultados

La tinción de Gram es una técnica fundamental en microbiología, crucial para la diferenciación entre dos grupos principales de bacterias en función de las propiedades de su pared celular. Desarrollado por Hans Christian Gram en 1882, este método de tinción se ha convertido en un protocolo estandarizado utilizado en laboratorios de todo el mundo. En esta guía completa, profundizamos en los intrincados detalles del protocolo de tinción de Gram, explorando su principio, procedimiento e importancia en el diagnóstico microbiológico.

¿Qué es una tinción de Gram?

La tinción de Gram es una prueba de laboratorio que se realiza para identificar bacterias presentes en muestras obtenidas de sitios sospechosos de infección o fluidos corporales. Esto implica la aplicación de una serie de tintes a la muestra, lo que conduce a la visualización de bacterias bajo un microscopio. El proceso de tinción ayuda a clasificar las bacterias como Gram positivas o Gram negativas según su reacción a la tinción.

Principio de la tinción de Gram:

La tinción de Gram aprovecha las diferencias en la estructura y composición de las paredes celulares bacterianas para clasificarlas en dos grupos distintos: grampositivas y gramnegativas.

• Bacterias Gram positivas: Estas bacterias poseen una gruesa capa de peptidoglicano en sus paredes celulares, que retiene el tinte violeta cristal durante la tinción y le da un color azul violeta.

• Bacterias Gram-negativo: Por el contrario, las bacterias Gram negativas tienen una fina capa de peptidoglicano y una membrana lipídica externa. Durante la tinción, pierden el tinte violeta cristal, pero se tiñen con un tinte rojo, pareciendo rosado o rojo bajo el microscopio.

Procedimiento de tinción de Gram

La tinción de Gram implica una serie de pasos:

1. Preparación de la muestra:

• Aplique una pequeña cantidad de la muestra, obtenida del sitio de sospecha de infección o fluido corporal, a un portaobjetos de microscopio limpio.
• Calienta el portaobjetos pasándolo a través de la llama de un mechero Bunsen varias veces. Este proceso asegura que la muestra se adhiera bien al portaobjetos.

2. Proceso de tinción:

a. Aplicación de Cristal Violeta:

• Inundar la muestra termofijada con solución de cristal violeta, cubriendo todo el portaobjetos.
• Deje que el cristal violeta repose durante un período de tiempo específico, generalmente alrededor de un minuto.

b. Adición de solución de yodo de Gram:

• Aplique solución de yodo de Gram al portaobjetos, cubriendo completamente la muestra teñida.
• El yodo forma un complejo con el cristal violeta, lo que fortalece su adhesión a la pared celular bacteriana.

C. Descolorización:

• Agregue gradualmente el decolorante (p. ej., etanol o acetona) al portaobjetos, gota a gota.
• Este paso es crítico y requiere un seguimiento cuidadoso. Una decoloración excesiva puede provocar resultados falsos negativos para las bacterias Gram positivas.

d. Contratinción con Safranina:

• Después de la decoloración, lave el portaobjetos con agua para eliminar el exceso de decolorante.
• Aplicar una solución de safranina al portaobjetos, cubriendo toda la muestra.
• La safranina sirve como contratinción, dando un color rojo contrastante a las bacterias Gram-negativas.

3. Examinación microscópica:

• El portaobjetos debe examinarse al microscopio, utilizando inicialmente el objetivo X40 para evaluar la distribución del frotis. Luego, examínelos utilizando el objetivo de inmersión en aceite X100.
• Todas las áreas del portaobjetos requieren un examen inicial. Se deben examinar las áreas que tienen solo una celda de espesor. Las áreas gruesas de las diapositivas suelen dar resultados variables e incorrectos.
• Los glóbulos blancos y los macrófagos se tiñen como gramnegativos, mientras que las células epiteliales escamosas se tiñen como grampositivos.

Interpretación de resultados:

La interpretación de los resultados es crucial para determinar la presencia y el tipo de bacterias en la muestra.

• Bacterias Gram positivas: Conserve el tinte violeta cristal, que se ve violeta o azul bajo el microscopio.
• Bacterias Gram-negativo: Pierden el color violeta cristal pero se tiñen de amarillo, pareciendo rosa o rojo.

Factores que interfieren con la tinción de Gram:

La tinción de Gram, al ser un procedimiento sensible, puede verse afectada por varios factores:

1. Colección de muestras: La recolección estéril adecuada es crucial para evitar la contaminación. El uso previo de antibióticos puede dificultar el crecimiento del organismo.
2. Análisis en baja potencia (10X):

• El fondo debe aparecer gramnegativo o claro.
  • Los glóbulos blancos tienen una tinción gramnegativa; su tinción con grampositivos puede indicar errores.
  • Diferenciar el cristal violeta de las bacterias es crucial.
  • Los frotis deben ser uniformes y de una celda de espesor sin superposición.

• Tenga en cuenta el número relativo de células, como leucocitos y células epiteliales.
• Observe las disposiciones y formas de las bacterias en busca de pistas para su identificación.

• Identificar y documentar la morfología bacteriana, incluida la forma, los bordes, los lados y el eje.
  • Nótese el pleomorfismo, las ramas o las extensiones.

El cumplimiento de estas pautas garantiza una interpretación precisa de la tinción de Gram, lo que ayuda a un diagnóstico y tratamiento precisos de las infecciones bacterianas.

Significación clínica:

Las tinciones de Gram ayudan en el diagnóstico de infecciones bacterianas y guían las decisiones de tratamiento al proporcionar resultados preliminares rápidos sobre el tipo de bacteria presente.

Conclusión:

La tinción de Gram sigue siendo una herramienta invaluable en microbiología, ya que permite una diferenciación rápida y confiable de tipos bacterianos. Al comprender el principio, el procedimiento y la interpretación de los resultados, los proveedores de atención médica pueden tomar decisiones informadas sobre la atención al paciente y las estrategias de tratamiento en casos de sospecha de infecciones bacterianas.

Referencias:

1. Leopold JA, Ferraro MJ. (2020). Conceptos y Aplicaciones de Microbiología. Educación McGraw-Hill.
2. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. (2007). Microbiología diagnóstica de Bailey & Scott. Mosby Elsevier.
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5. Sociedad Estadounidense de Microbiología. (2005). Protocolo básico 1: tinción de Gram de cultivos bacterianos. En: Walker JM, editor. El manual de protocolos de proteínas. Prensa Humana.

Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias Gram negativas (thesciencenotes.com)