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Ciencia

Diseño de estudio de biomarcadores proteómicos: enfoques de exploración y seguimiento

Esta publicación de blog fue escrita en asociación con Ray Biotech, que proporciona tecnologías de vanguardia que aceleran el descubrimiento de biomarcadores de proteínas y factores clave relacionados con enfermedades, la identificación de nuevos objetivos farmacológicos y el avance de la medicina personalizada. En esta publicación de blog, Ray Biotech brinda una explicación detallada de preguntas de investigación comunes relacionadas con los estudios de biomarcadores proteómicos. Sus servicios están disponibles en el mercado Scientist.com.

La proteómica es el estudio de las interacciones, funciones, composición y estructuras de las proteínas. Proporciona una mejor comprensión de la actividad celular real que la genómica. Los objetivos de un estudio proteómico pueden ser comprender el mecanismo de una enfermedad, evaluar las respuestas moleculares a las terapias, establecer criterios de diagnóstico, evaluar funciones celulares y más.

Al elegir un enfoque para responder a sus preguntas de investigación, es importante elegir la mejor metodología analítica para sus bioespecímenes y objetivos. En este blog, analizamos las consideraciones más importantes al planificar su estudio de biomarcadores con métodos proteómicos de afinidad.

¿Qué metodologías de análisis de proteínas ofrecéis?

Perfil de expresión

RayBiotech es un fabricante líder de matrices de anticuerpos y otras plataformas proteómicas de afinidad. Hemos desarrollado plataformas en varios niveles de tamaño, alcance y sensibilidad para adaptarse a una amplia gama de presupuestos y objetivos. El primer paso para la mayoría de los estudios de biomarcadores de proteínas es el perfil de expresión para identificar proteínas expresadas diferencialmente en una población con enfermedad versus control. Esto se puede hacer a la escala más amplia utilizando nuestros paneles de matriz de anticuerpos que cubren entre 1000 y 8000 proteínas. Si se desea un resultado cuantitativo, el investigador puede seleccionar un panel humano de 1200 objetivos, un panel murino de 640 objetivos o un panel de ratas de 282 objetivos, todos los cuales emplean inmunodetección de pares de anticuerpos tipo sándwich para lograr la mayor sensibilidad y especificidad. Para lograr el mayor contenido, se encuentran disponibles paneles semicuantitativos: 8.000 proteínas humanas, 2.808 proteínas murinas, 1.500 proteínas de rata o 500 proteínas de conejo; Estas plataformas utilizan inmunocaptura en fase sólida con etiquetado directo con biotina.

El investigador también puede optar por perfilar un panel más pequeño de objetivos (10-200 proteínas) centrándose en cambios en ciertas vías biológicas, procesos o tipos de moléculas. RayBiotech fabrica una amplia variedad de kits de matrices prevalidados con paneles seleccionados por investigaciones. Por lo tanto, la selección del panel de matriz debe reflejar 1) las moléculas de interés, 2) qué tan amplia o específica el investigador necesita que sea la pregunta inicial y 3) si el resultado cuantitativo es esencial para el estudio. Por ejemplo, Dorien et al. utilizaron el Human L1000 Array (un conjunto de detección semicuantitativo de 1000 proteínas), junto con el Quantibody® Human Cytokine Array 640 (un conjunto cuantitativo de 640 proteínas) para identificar posibles biomarcadores en muestras de plasma de pacientes con endometriosis. La matriz identificó 4 proteínas expresadas diferencialmente que luego se validaron mediante ELISA cuantitativo, y 1 proteína se identificó como un biomarcador potencial (Reprod Sci. 2020 Feb;27(2):751-762).

Imágenes representativas que muestran el análisis de 2 muestras de suero de ratón con el RayBio Mouse L-Series Array [AAM-BLG-2]que detecta 500 proteínas.

Perfiles PTM

Además de la expresión general, las diversas proteoformas de un biomarcador pueden ser relevantes en el proceso de la enfermedad. Esto se puede cuestionar con otro enfoque de descubrimiento: perfiles proteoformos, que detecta modificaciones postraduccionales a gran escala. Con este fin, la gama única de matrices de modificación postraduccional (PTM) de RayBiotech utiliza paneles de matriz de anticuerpos de alta densidad (500-8000 proteínas) con etiquetado químico específico o agentes de afinidad para identificar el estado de nitrosilación, acetilación, palmitoilación, oxidación y glicosilación. o fosforilación. de cada proteína en el panel. La identificación de proteoformas es el primer paso hacia la comprensión de las funciones de proteoformas específicas, así como el descubrimiento de firmas moleculares para el diagnóstico de enfermedades o la identificación de posibles objetivos farmacológicos.

Siguiendo

Una vez que los estudios exploratorios hayan identificado una o un pequeño subconjunto de proteínas candidatas, puede ser necesario realizar un seguimiento de los cambios a lo largo del tiempo o entre grupos experimentales. Con este fin, RayBiotech también proporciona un ensayo singleplex para un análisis de proteínas preciso y sensible. Las opciones incluyen kits de ELISA cuantitativos o un servicio de transferencia Western, los cuales pueden detectar tanto la expresión como la fosforilación de proteínas u otras PTM. Para candidatos a biomarcadores que son de baja abundancia y difíciles de detectar, dos métodos ultrasensibles están disponibles. El inmuno-PCR ELISA (IQELISA®) de RayBiotech es un inmunoensayo estándar basado en sándwich que utiliza un oligo de ADN para marcar el inmunocomplejo, lo que permite la lectura de PCR en tiempo real. Este formato normalmente proporciona un LOD 10 veces menor en comparación con el ELISA colorimétrico correspondiente. Si se requiere más sensibilidad, RayBiotech ofrece un ensayo de proteína de molécula única (SIMOA) de servicio completo, que puede detectar hasta el nivel de femtogramos (fg/mL). Este ensayo utiliza perlas recubiertas de anticuerpos, un anticuerpo de detección conjugado fluorescente y una lectura digital para lograr la cuantificación de biomarcadores en concentraciones que son difíciles o imposibles de medir con cualquier otro método.

¿Cómo puedo determinar el mejor enfoque para mi tipo de muestra y objetivos de investigación?

La determinación del enfoque óptimo puede depender de varios factores relacionados con los insumos, incluido el número, el tipo y el volumen de muestra disponible para el estudio. También se deben considerar los resultados, como las comparaciones de grupos, las preguntas y los objetivos del estudio. Sin embargo, debido a que la cantidad de muestra disponible dicta qué enfoques son posibles, el volumen de la muestra debe determinarse primero por una cuestión práctica.

Volumen de la muestra

La cantidad de muestra necesaria para el análisis depende de la dilución de la muestra y del tipo de análisis utilizado. En la proteómica de afinidad, puede ocurrir un fenómeno llamado «efecto de matriz de muestra» (SME), que afecta la capacidad de un anticuerpo para unirse a su molécula objetivo, confundiendo los resultados. Por lo tanto, recomendamos una dilución de al menos el doble para cada muestra biológica. Para perfiles de expresión proteómica cuantitativa de 1200 proteínas, se requieren 1,5 ml de suero/plasma y otros fluidos biológicos o 3 ml de medio de cultivo celular. Alternativamente, el perfil de expresión proteómica semicuantitativa de 8000 proteínas requiere solo 40 µl de suero/plasma y otros fluidos biológicos o medios de cultivo celular. Para lisados ​​de células o tejidos, buenos puntos de partida son: 500 µl de tampón de lisis por millón de células o 10 mg de tejido; para muestras de medios de cultivo celular, siembre aproximadamente 1 millón de células en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm y luego cultive durante 5 días. Por lo tanto, el material de partida y el volumen pueden dictar el enfoque posterior.

Tipo de ejemplo

Si el ensayo está validado o es adecuado para su uso en el tipo de muestra disponible también es una consideración importante a la hora de determinar el mejor enfoque. Las plataformas RayBiotech pueden medir proteínas en 15 especies diferentes, incluidas muchas especies acuáticas y de mamíferos comunes (humanos, ratones, ratas, primates no humanos, vacas, caballos, perros, gatos, ovejas, pollos, cerdos, conejos, peces cebra, delfines), así como así como cepas bacterianas y virales (E. colicélulas huésped, SARS-COV-2, MPOX, VPH, VHC, VIH, etc.).

RayBiotech valida metodologías de análisis de proteínas en muestras combinadas de suero y plasma normales y, según el ensayo particular, también las prueba en una variedad de tipos de muestras, incluidos medios de cultivo celular, lisados ​​de células y tejidos, orina, lágrimas, saliva y otros fluidos biológicos. . . Las publicaciones que citan los arreglos RayBio® utilizados con tipos de muestras alternativos se pueden encontrar en nuestra base de datos de publicaciones, que puede proporcionar más orientación sobre la idoneidad del arreglo para un tipo de muestra en particular. Por ejemplo, Jovanovic. et al. utilizaron el RayBio L6000 Array con lisados ​​de osteoblastos de pacientes de control y con osteogénesis imperfecta tipo XIV. Este enfoque identificó proteínas expresadas diferencialmente y reveló que las proteínas relacionadas con la adhesión celular se vieron afectadas, lo que complementó los datos transcriptómicos (Matrix Biol. 2023 agosto: 121: 127-148). En otro estudio, el desmalezado et al. utilizó RayBio Kiloplex (rango cuantitativo objetivo de 1000) para el análisis proteómico de muestras de orina de pacientes con nefritis lúpica. Aquí, la matriz identificó una firma urinaria asociada con tratamientos específicos, que podría informar futuras estrategias de monitoreo de medicamentos (Lupus Sci Med. 2022; 9(1): e000763).

Expresión del factor de crecimiento en muestras de humor vítreo medida con el Quantibody Human Growth Factor Array.

Como escoger

Además de los factores mencionados anteriormente, el principio/formato de diseño de la plataforma del arreglo también se puede considerar al elegir el mejor enfoque. Las matrices de anticuerpos pueden estar basadas en perlas citométricas (leídas mediante citometría de flujo), basadas en membranas de nitrocelulosa (leídas mediante imágenes quimioluminiscentes) o en portaobjetos de vidrio (leídas mediante un escáner de micromatrices del láser). Por lo tanto, el equipo de detección disponible del investigador puede dictar qué tipo de matriz es el más práctico de usar, si decide ejecutar la matriz en su propio laboratorio.

RayBiotech’s Cómo elegir una infografía de matriz incluye un resumen visual de estos factores para ayudarle a guiar su decisión. La infografía se puede descargar aquí. Para obtener una comparación técnica detallada de las distintas plataformas de la gama, consulte este artículo.

¿Cómo analizo/interpreto mis datos?

Una vez que haya establecido su enfoque, haya determinado el diseño experimental y haya completado el experimento, puede resultar difícil determinar cómo analizar e interpretar conjuntos de datos grandes y complejos que incluyen cientos de muestras y miles de proteínas. Se pueden perder muchas horas explorando los datos sin responder con éxito a las importantes preguntas de investigación que el estudio se propuso plantear. El informe de análisis estándar de RayBiotech contiene datos sin procesar y procesados, incluida la concentración final o la intensidad de la señal para cada analito y cada muestra. Estos datos ya están limpios y estandarizados, lo que permite una transición fluida a análisis estadísticos más profundos si es necesario.

Servicios Bioestadísticos

También tiene la opción de consultar con los expertos en bioinformática de RayBiotech para crear un informe de análisis personalizado para sus datos proteómicos o genómicos. Ya sea que necesite un análisis de conglomerados, un análisis de vías o una selección de biomarcadores, podemos ayudarlo a encontrar las respuestas ocultas a sus preguntas de investigación. Nuestras capacidades también incluyen la integración de múltiples conjuntos de datos (NGS, RNA Seq, perfiles metabolómicos, etc.) utilizando una variedad de métodos, incluido el modelado predictivo, la mediación, la asociación GO/KEGG, la red de análisis y más.

Como la primera empresa en comercializar la matriz de proteínas y líder innovador en análisis de proteínas multiplex, RayBiotech tiene las herramientas y la experiencia adecuadas para avanzar con éxito en los proyectos de descubrimiento de proteínas: sus biomarcadores. El equipo de científicos y asesores técnicos de RayBiotech puede guiarlo a través del diseño experimental, elegir el mejor ensayo, realizar el experimento y analizar los datos. Si tiene una idea para un proyecto, envíenos una solicitud a través del portal Scientist.com.

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