Exploración en profundidad de nuevos enfoques de búsqueda de resultados utilizando HTS y FBS
Esta publicación de blog fue escrita en asociación con Eurofins Discovery, líder mundial en pruebas científicas y servicios de laboratorio para el avance del descubrimiento de fármacos y la salud humana.
Identificar los éxitos más prometedores y los clientes potenciales con propiedades «similares a las de los fármacos» en el menor tiempo es el objetivo principal del descubrimiento de fármacos. Los candidatos preclínicos exitosos se seleccionan utilizando estrategias sólidas de detección de aciertos. Para llevar a cabo una campaña eficaz de descubrimiento de fármacos, es esencial comprender los beneficios que se pueden derivar de cada paso de una cascada integral de identificación de resultados. Con el objetivo de demostrar claramente estas ventajas, Eurofins Discovery llevó a cabo una exploración en profundidad de la quinasa PIM3 utilizando tanto el cribado de alto rendimiento (HTS) convencional como el cribado basado en fragmentos (FBS).
Se eligió la quinasa PIM3 para este estudio de caso, ya que el descubrimiento de fármacos inhibidores de quinasas es particularmente desafiante debido a la conservación de los sitios activos y el alto nivel de homología estructural entre las quinasas que puede generar problemas de seguridad. Utilizando una cascada de detección integral diseñada por HTS y los expertos en biofísica de Eurofins Discovery, el equipo pudo identificar rápidamente inhibidores selectivos de la quinasa PIM3 a partir de las bibliotecas patentadas de la compañía. Los resultados positivos de este estudio de caso proporcionan una base sólida para demostrar que las técnicas se pueden utilizar para identificar rápidamente series de éxito innovadoras y tratables para otros programas Hit-to-Lead.
El primer paso en esta investigación fue implementar una cascada HTS que integró todas las fases del desarrollo de ensayos para la detección primaria (ensayos ADP-Glo™ sobre PIM3 quinasa activa recombinante producida por Eurofins DiscoverX®). Luego, el equipo realizó un análisis biofísico biofísico de cambio espectral MST-TRIC y ensayos celulares basados en la participación del objetivo (TE) NanoBRET™ para confirmar y clasificar los aciertos de la quinasa PIM3 identificados. Se combinaron varios ensayos disponibles para investigar rápidamente la selectividad de acierto para la quinasa PIM3 frente a las quinasas PIM1 y PIM2 y todo el kinoma, así como las características tempranas de ADME, es decir, la solubilidad y la estabilidad del microsoma del ser humano/ratón.
Detección de alto rendimiento de PIM3 quinasa y detección basada en fragmentos
DiscoverX® produjo la quinasa PIM3 activa recombinante para desarrollar un ensayo ADP-Glo™ primario robusto de alto rendimiento utilizado para detectar un subconjunto de la biblioteca PlatinumDiv+ Eurofins Discovery (71.000 compuestos). Se obtuvieron conjuntos de datos de alta calidad (Z’ = 0,86 ± 0,05) con una tasa de aciertos del 1,54 %, lo que permitió la selección de 1.000 aciertos (946 confirmados en las curvas de respuesta a la dosis de ADP -Glo™ (DRC), que muestran un pIC50 de 3,42 a 7,72).
La fase DRC confirmó la solidez y la alta calidad (95,6 % de confirmación de acierto) de los datos obtenidos de la pantalla primaria ADP-Glo™. En esta etapa, era esencial identificar los compuestos más prometedores mediante un enfoque ortogonal, como el análisis biofísico, así como el uso de análisis de interacción con objetivos celulares con el ensayo PIM3 NanoBRET™. Antes de la fase de DRC, el equipo de química medicinal de Eurofins Discovery revisó la estructura y las propiedades químicas de los 946 resultados confirmados para seleccionar los 140 resultados más manejables para realizar pruebas adicionales mediante ensayos ortogonales.
Tras la validación del desarrollo del ensayo, la tecnología Spectral Shift permitió clasificar los compuestos según la afinidad (KD valores). De los 946 resultados confirmados, se probaron 140 moléculas seleccionadas en un experimento de dosis-respuesta, una serie de diluciones dobles a partir de 30 µM. De 140 compuestos, 128 fueron identificados como aglutinantes para la quinasa PIM3 (tasa de aciertos del 92 %); 22 compuestos mostraron afinidad en el rango submicromolar (Figura 3-A). Para confirmar su fuerza de unión y su efecto estabilizador, la TSA probó los 19 aglutinantes de PIM3 más fuertes (Figura 3). Todos los compuestos mostraron una estabilización drástica de PIM3 con una ganancia de 3 a 12 °C en comparación con la quinasa apo-PIM3.
**Figura 3. Biofísica utilizada como análisis ortogonal para clasificar los aciertos de vinculantes.** Distribución de frecuencia de los aglutinantes con su KD
Además de la confirmación MST-TRIC, los 140 compuestos seleccionados se confirmaron utilizando el ensayo de quinasa PIM3 celular NanoBRET™ TE (Z’ = 0,83 ± 0,06). De los 140 aciertos identificados, se confirmaron 128 aglutinantes en MST-TRIC (pKD de 3,63 a 8,03) y 67 aciertos en un ensayo NanoBRET™ (pIC50 de 5,55 a 6,71). Después de la clasificación, se retuvieron y caracterizaron 16 aciertos distribuidos en 6 grupos en KinaseProfiler™ (actividad quinasa) y KINOME, propiedad de Eurofins Discovery.escanear® (ensayo de unión de competencia directa en el sitio activo). KinaseProfiler™ y KINOMEescanear® se utilizaron para investigar la selectividad de los ataques contra las quinasas PIM1 y PIM2 (IC50 y KD) y ayudar a identificar dos grupos que mostraron una selectividad razonable para la quinasa PIM3. Paralelamente, los 16 hits se caracterizaron por su solubilidad y estabilidad, lo que llevó a la selección de tres de los seis clusters para iniciar el programa Hit-to-Lead.
Paralelamente a la exploración de HTS & Biophysics sobre la quinasa PIM3, Eurofins Discovery llevó a cabo una segunda estrategia de identificación de éxito: la cascada FBS con la biblioteca Eurofins Discovery Fragment ProbeSet. El equipo utilizó el MST-TRIC Spectral Shift como ensayo primario y el ensayo de desplazamiento térmico (TSA) como ensayo de confirmación.
De una selección de 826 fragmentos, se identificaron 91 aglutinantes potenciales (tasa de éxito del 11 %) en el cribado de dosis única, y se confirmaron 69 fragmentos como aglutinantes de PIM3 con KD valores desde 6,31 mM hasta 25,1 µM. Los 33 fragmentos más afectados se probaron en TSA y seis se identificaron como estabilizadores (∆Tm > 1 °C). A través de la investigación del mecanismo de acción (MoA), Eurofins Discovery identificó tres sustancias de unión alostérica, fragmentos prometedores para futuros trabajos de biología estructural de PIM3.
Conclusión
Como se destaca en el estudio de caso de Eurofins Discovery, se implementaron con éxito dos cascadas de detección sólidas y complementarias en la quinasa PIM3. La campaña HTS permitió la identificación de inhibidores de quinasa altamente selectivos y tratables en cuestión de semanas, proporcionando una base sólida para los programas posteriores Hit-to-Lead y Lead Optimization. La estrategia FBS permitió identificar una breve lista de fragmentos prometedores, junto con información muy valiosa que incluye su fuerza de unión, indicaciones sobre su sitio de unión, así como su capacidad para estabilizar PIM3.
El enfoque HTS puede generar rápida y eficientemente candidatos preclínicos confiables y con el enfoque FBS se pueden aislar nuevos sitios de unión. Además, los impactos de fragmentos se pueden utilizar para crear moléculas pequeñas realizando un enfoque de crecimiento de fragmentos o un enfoque de ligación de fragmentos.
Estas estrategias de detección muestran la importancia de tener acceso a bibliotecas de compuestos de alta calidad, proteínas purificadas y diversas tecnologías utilizadas para HTS y FBS. Combinados con una gestión eficiente de proyectos y habilidades científicas, estos conducen a campañas de búsqueda exitosas de alto rendimiento.
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